Rapido e macchia - Taiwan Stepper Driver Co., Ltd

Nature Biomedical Engineering volume 7, pagine 1040–1052 (2023)Citare questo articolo

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Un test sulla placca, il metodo gold standard per misurare la concentrazione di virioni litici competenti per la replicazione, richiede la colorazione e solitamente più di 48 ore di runtime. Qui mostriamo che l’imaging olografico senza lenti e il deep learning possono essere combinati per accelerare e automatizzare il test. Il dispositivo di imaging compatto cattura informazioni sulla fase senza etichetta a una velocità di circa 0,32 gigapixel all'ora per pozzetto, copre un'area di circa 30 × 30 mm2 e un intervallo dinamico di concentrazione del virus 10 volte più ampio rispetto ai test standard e quantifica i virus infetti area e il numero di unità formanti la placca. Per il virus della stomatite vescicolare, il test automatizzato della placca ha rilevato i primi eventi di lisi cellulare causati dalla replicazione virale già 5 ore dopo l’incubazione e in meno di 20 ore ha rilevato unità formanti placca a tassi superiori al 90% al 100% specificità. Inoltre, ha ridotto il tempo di incubazione del virus dell’herpes simplex di tipo 1 di circa 48 ore e quello del virus dell’encefalomiocardite di circa 20 ore. Il test privo di macchie dovrebbe essere utilizzabile nella ricerca virologica, nello sviluppo di vaccini e nella diagnosi clinica.

Le infezioni virali possono colpire milioni di persone in tutto il mondo attraverso malattie infettive come l’influenza, il virus dell’immunodeficienza umana e il papillomavirus umano1. I Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie hanno stimato che, dal 2010, il virus dell’influenza ha provocato 16-53 milioni di malattie, 0,2-1 milione di ricoveri e 16.700-66.000 decessi solo negli Stati Uniti2,3. Inoltre, la pandemia di COVID-19, che ha causato più di 500 milioni di contagi e più di 6 milioni di decessi in tutto il mondo, ha comportato un onere enorme sulla salute pubblica e sullo sviluppo socioeconomico di molti paesi4. Per contribuire a far fronte a tali sfide sanitarie globali, è necessario sviluppare tecniche di quantificazione del virus accurate e a basso costo per la diagnosi clinica5, lo sviluppo di vaccini6 e la produzione di proteine ricombinanti7 o agenti antivirali8,9.

Sviluppato nel 1952, il test delle placche è stato il primo metodo per quantificare le concentrazioni di virus. Sviluppato da Renato Dulbecco, il test consente di determinare manualmente il numero di unità formanti placca (PFU) in un dato campione contenente virioni litici competenti per la replicazione10,11. Questi campioni vengono diluiti in serie e aliquote di ciascuna diluizione vengono aggiunte a una piastra di cellule in coltura10. Man mano che il virus infetta le cellule adiacenti e si diffonde, si forma gradualmente una placca che può essere ispezionata visivamente da un esperto. Grazie alla sua capacità unica di fornire l’infettività dei campioni virali in modo economicamente vantaggioso, il test su placca rimane il metodo gold standard per quantificare le concentrazioni di virus, nonostante l’esistenza di altri metodi12,13,14,15,16,17 ,18,19, come i test di formazione focale con immunofluorescenza14, la reazione a catena della polimerasi16 e i test basati su test immunoenzimatici19,20. Tuttavia, i test sulle placche richiedono solitamente un periodo di incubazione di 2-14 giorni (a seconda del tipo di virus e delle condizioni della coltura)21 per consentire alle placche di espandersi fino a raggiungere dimensioni visibili e sono soggetti a errori umani durante il processo manuale di conteggio delle placche22. Per migliorare i tradizionali test della placca sono stati sviluppati numerosi metodi23. Sebbene molti sistemi abbiano capacità uniche di visualizzare colture cellulari in piastre a pozzetti, richiedono marcatori di fluorescenza22 o piastre di coltura speciali con microelettrodi d'oro24. Inoltre, gli errori di conteggio umani continuano a rappresentare un problema per questi metodi. Un test della placca accurato, quantitativo, automatizzato, rapido ed economico sarebbe quindi vantaggioso per la ricerca virologica e le relative applicazioni cliniche.

Alcuni dei recenti sviluppi nell’imaging di fase quantitativa (QPI), nell’olografia e nell’apprendimento profondo offrono l’opportunità di rispondere a questa esigenza. La QPI è una tecnica di imaging preminente che consente la visualizzazione e la quantificazione di campioni biologici trasparenti in modo non invasivo e senza etichetta25,26. Inoltre, la qualità dell'immagine dei sistemi QPI può essere migliorata utilizzando le reti neurali migliorando, in particolare, il recupero di fase27, la riduzione del rumore28, la messa a fuoco automatica29,30 e la risoluzione spaziale31. Inoltre, sono stati mostrati numerosi metodi di rilevamento e identificazione di microrganismi basati sull'apprendimento profondo utilizzando QPI32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42.

90% PFU detection rate in <20 h, providing major time savings compared with the traditional plaque assays, which take ≥48 h. Furthermore, we show an average incubation time saving of ~48 h and ~20 h for HSV-1 and EMCV, respectively, achieving a PFU detection rate >90% with 100% specificity. A quantitative relationship was also developed between the incubated virus concentration and the virus-infected area on the cell monolayer. Without any extra sample-preparation steps, this deep-learning-enabled label-free PFU imaging and quantification device can be used with various plaque assays in virology and might help to expedite research in vaccine and drug development./p>95% coverage. During the virus infection, five wells were infected by 100 µl of the diluted VSV suspension (obtained by diluting a 6.6 × 108 PFU ml−1 VSV stock with a dilution factor of 2−1 × 10−6), and one well was left for negative control. Then, 2.5 ml of the overlay solution containing the total medium with 4% agarose was added to each well (see Methods for details, ‘Preparation of agarose overlay solution’). After the solidification of the overlay at room temperature, each sample was first placed into our imaging set-up for 20 h of incubation, performing time-lapse imaging to capture the spatiotemporal information of the sample. Then, the same sample was left in the incubator for an additional 28 h to let the PFUs grow to their optimal size for the traditional plaque assay (this is only used for comparison purposes). Finally, each sample was stained using crystal violet solution to serve as the ground truth to compare against our label-free method./p>90% at 20 h of incubation without having any false positives at any time point despite using no staining./p>1%), a faster PFU concentration readout can be provided at 12 h or 15 h. As the size of an average PFU on the well is physically larger at 15 h of incubation compared with 12 h, the slope of the red calibration curve in Fig. 6b is smaller than in Fig. 6a, as expected. For samples with even higher virus concentrations, the infected cell area percentage could reach >1% in ≤10 h of incubation (shown in Fig. 5c), providing the PFU concentration readout even earlier./p>70 °C during its operation, which could disturb the growth of the sample and vaporize the agarose layer, especially for regions that are near the sensor parking location between successive holographic scans. Hence, a cooling system was built using fans (QYN1225BMG-A2, Qirssyn). We also sealed the sides of the sample using parafilm (product number 13-374-16, Fisher Scientific) and opened four holes on the top cover to form a gentle ventilation system, which is an inexpensive and easy-to-implement solution to avoid sample drying./p>90% detection rate for VSV PFUs with 100% specificity in <20 h./p>11 TB) is available from the corresponding author on reasonable request./p>