Gli stimoli meccanici attivano l'espressione genica attraverso un percorso di rilevamento dello stress dell'involucro cellulare

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13979 (2023) Citare questo articolo

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I meccanismi meccanosensibili vengono spesso utilizzati per rilevare danni alla struttura dei tessuti, stimolando la sintesi e la riparazione della matrice. Sebbene questo tipo di processo di meccanoregolazione sia ben riconosciuto nei sistemi eucariotici, non è noto se tale processo avvenga nei batteri. Nel Vibrio cholerae, il danno indotto dagli antibiotici alla parete cellulare portante promuove un aumento della segnalazione da parte del sistema a due componenti VxrAB, che stimola la sintesi della parete cellulare. Qui mostriamo che i cambiamenti nello stress meccanico all'interno dell'involucro cellulare sono sufficienti per stimolare la segnalazione VxrAB in assenza di antibiotici. Abbiamo applicato forze meccaniche ai singoli batteri utilizzando tre distinte modalità di caricamento: caricamento per estrusione all'interno di un dispositivo microfluidico, compressione diretta e pressione idrostatica. In tutti i casi, la segnalazione VxrAB, come indicato da un reporter di proteine fluorescenti, era aumentata nelle cellule sottoposte a carichi meccanici di entità maggiore, quindi diverse forme di stimoli meccanici attivano la segnalazione VxrAB. La riduzione della rigidità dell'involucro cellulare in seguito alla rimozione dell'endopeptidasi ShyA ha portato a grandi aumenti nella deformazione dell'involucro cellulare e ad un aumento sostanziale della risposta VxrAB, supportando ulteriormente la reattività di VxrAB. I nostri risultati dimostrano un sistema di regolazione del gene meccanosensibile nei batteri e suggeriscono che i segnali meccanici possono contribuire alla regolazione dell’omeostasi della parete cellulare.

Le forze meccaniche sono da tempo riconosciute come fattori chiave che contribuiscono alla crescita e al funzionamento degli organismi. Nei sistemi dei mammiferi, le forze meccaniche regolano un'ampia varietà di processi, tra cui la differenziazione cellulare durante lo sviluppo1,2, l'inizio e la progressione della malattia3 e l'omeostasi dei tessuti4. Nei tessuti e negli organi con funzioni portanti, le forze meccaniche spesso agiscono come segnale primario che avvia il rimodellamento e la riparazione dei tessuti, consentendo così al tessuto di adattarsi alle sfide meccaniche dell’ambiente e di tornare rapidamente a sostenere il carico. Il rimodellamento tissutale mantiene quindi l’omeostasi della funzione meccanica bilanciando la rimozione del tessuto danneggiato con la sintesi tissutale. Le strutture portanti, tra cui le ossa5, i vasi sanguigni6 e il citoscheletro della pianta7,8, utilizzano meccanismi meccanosensibili per mantenere la funzione meccanica.

La maggior parte degli studi di meccanobiologia si concentrano sui sistemi eucariotici9, sebbene prove recenti abbiano evidenziato l’importanza delle forze meccaniche nei procarioti. Nei batteri, le appendici extracellulari, compresi i flagelli e i pili di tipo IV, si estendono dal corpo cellulare per percepire e rispondere ai segnali meccanici nell'ambiente. Il montaggio e lo smontaggio dell'unità motore flagellare rispondono agli aumenti e alle diminuzioni del carico meccanico esterno10,11. L'inibizione fisica della rotazione flagellare mediante contatto con una superficie genera forze di reazione all'interno del motore molecolare, che stimolano l'adesione superficiale e la formazione di biofilm12,13. I pili di tipo IV sono fibre motorizzate che si estendono e si ritraggono per interagire con l'ambiente. Inoltre, il meccanosensing da parte dei pili di Tipo IV promuove la formazione di biofilm14 e il rilascio di fattori di virulenza15 e guida la motilità dopo le collisioni16.

L'involucro cellulare è il principale componente portante dei batteri ed è anche sensibile alle forze meccaniche. I canali ionici attivati dallo stiramento all'interno della membrana cellulare rispondono rapidamente ai cambiamenti di osmolarità aprendosi a causa dello stiramento della membrana, portando ad un aumento della sopravvivenza in seguito allo shock ipoosmotico17. Lo stress meccanico e la tensione all'interno dell'involucro cellulare influenzano anche l'assemblaggio dei complessi di efflusso trans-involucro; ad esempio, l'assemblaggio e il funzionamento della pompa di efflusso multicomponente trans-involucro CusCBA sono compromessi dall'aumento dello stress di taglio ottaedrico all'interno dell'involucro cellulare18. Lo stress meccanico all'interno dell'involucro cellulare influenza anche le posizioni di inserimento della nuova parete cellulare nei batteri sottoposti a flessione, con maggiori quantità di parete cellulare inserite nelle regioni di maggiore deformazione tensile19,20. Sebbene questi meccanismi meccanosensibili all’interno dell’involucro cellulare siano ben riconosciuti, nessuno dei meccanismi identificati fino ad oggi ha dimostrato di regolare l’espressione genica correlata al rimodellamento della parete cellulare, una componente essenziale dell’involucro cellulare. È stato ipotizzato che anche i sistemi di regolazione genetica attualmente associati ad altre forme di stress cellulare possano essere meccanosensibili21 e un recente rapporto suggerisce che il confinamento migliora la segnalazione Rcs e la conseguente resistenza al batteriofago in E. coli22. Se i meccanismi meccanosensibili sono coinvolti nel rimodellamento e nell’omeostasi dell’involucro cellulare, ci si aspetterebbe che lo stress meccanico e la tensione regolino la sintesi dei componenti dell’involucro cellulare.

50 MPa) causes changes to RNA synthesis and DNA replication and can cause cell death35; here we apply mild hydrostatic pressure of 0–100 kPa (a bacterium 10 m underwater experiences approximately 100 kPa hydrostatic pressure), in contrast a cell leaving a host gastrointestinal system and entering brackish water is expected to experience an increase in turgor pressure of 500 kPa. Hydrostatic pressure increases the compressive stresses perpendicular to the cell envelope. The magnitude of mechanical stresses caused by hydrostatic pressure are typically much smaller than the hoop and longitudinal stresses (oriented parallel to the cell envelope surface) generated by extrusion loading or compression, but under conditions of applied hydrostatic pressure can become noticeable. Hydrostatic pressure was applied to cells suspended in liquid media in a custom chamber connected to a microfluidic pump. After 2 h of incubation at room temperature, cells were removed and visualized. Average cell fluorescence increased 28% with increasing magnitude of applied compression force (Fig. 2E, left), supporting the idea that VxrAB signaling is also sensitive to hydrostatic pressure. Upon deleting the vxrB box in the promoter, cell fluorescence did not vary with applied hydrostatic pressure (Fig. 2E, right), confirming that the mechanosensitive increase in cell fluorescence for PmurJ:msfGFP cells required VxrB activation. As in the compression experiments, the PvxrAB:msfGFP reporter strain were consistent with the observations with PmurJ:msfGFP (Fig. 2F). The variance in fluorescence was greater than that seen in compression loading, a finding we attribute to the fact that mechanical stresses in the cell envelope are limited to radial compression and are not as well controlled (cell contact with the walls of the device and other cells is completely uncontrolled). As a result, the mechanosensitive response to hydrostatic pressure was dominated by a subset of cells (upper portion of cell population in Fig. 2E,F). We conclude that VxrAB signaling is responsive to diverse methods of applying mechanical load to the cell envelope./p> 0.80 µm) so the cells could flow freely through all of the feeder channels and would only get stuck in the narrow constriction of the tapered channels. The feeder channel etch depth was characterized using a profilometer (P-7, KLA Inc, Milpitas CA, USA). The profilometer tip was too wide to measure the tapered channels, so an atomic force microscopy high aspect ratio tip was used to measure the etch depth of tapered channels (Veeco Icon Bruker, Billerica MA, USA). Channel etch depth was 0.88 ± 0.03 µm. A scanning electron microscope (Zeiss Ultra 55 SEM microscope, Oberkocken Germany) was used to measure the tapered channel inlet width (1.48 ± 0.07 µm) and outlet width (0.35 ± 0.02 µm). The tapered channel inlet is wide enough that cells can enter, and the outlet is narrow enough to prevent cells from flowing out./p>